▲ NIMH Workshop: Gene-based Therapeutics for Rare Genetic Neurodevelopmental Psychiatric Disorders     ©장애인인식개선신문

(서울=장애인인식개선신문) = 미 국립 정신 건강 연구소 , 희귀 유전적 신경 발달 정신 장애에 대한 유전자 기반 치료제  워크숍 매사추세츠 대학교(University of Massachusetts)의 광핑 가오(Guangping Gao) 발표 내용 

 

 

사본

광핑 가오 : 그래. 감사합니다. 제 이름은 Guangping Gao이고 먼저 마스크 업데이트와 마찬가지로 이 시의적절하고 중요한 워크숍을 조직하는 데 지칠 줄 모르는 노력을 기울인 NIH 동료와 지도자들에게 감사드립니다. 또한 연사와 의장, 패널리스트의 참여와 워크숍에 대한 중요한 공헌, 그리고 워크숍에 참석한 모든 참석자들에게 감사드립니다.

 

그래서 오늘 저의 과제는 희귀 질환에 대한 유전 기반 치료의 접근 방식과 도구에 대한 개요를 제공하는 것입니다. 이것은 나의 공개입니다. 그리고 인간의 질병은 크게 두 가지로 분류할 수 있다. 하나는 후천성 질환이고 다른 하나는 유전성 유전병입니다. 유전 질환의 원인에는 상 염색체 열성 돌연변이, 상 염색체 우성 돌연변이, X 연관 돌연변이 및 일배 체력 부전이 포함됩니다. 따라서 이러한 유전적 돌연변이의 결과에는 기능 상실, 기능 획득 또는 독성 획득, 일배체 부족이 포함됩니다. 따라서 유전자 치료는 실제로 희귀 유전 질환, 특히 신경 발달 및 정신 장애에 대한 매우 매력적인 접근 방식입니다. 대부분이 유전적 결함으로 인해 발생하고 대부분이 단일 유전자 질환이기 때문입니다. 그리고 유전자 치료는 실제로 가장 직접적인 치료 가능성을 제공합니다.

 

이제 유전자 기반 치료 전략에 대한 개요를 제공하고자 합니다. 생체 내 유전자 치료라고 하는 첫 번째 접근 방식, 이 접근 방식에는 이 질병과 한 번 바이러스 유전자 치료의 두 가지 범주가 있습니다. 그리고 FDA 승인 AAV 약물을 예로 들었습니다. 두 번째 범주는 비 바이러스성이며 FDA 승인 핵산 약물을 사용합니다. 예를 들어, 여기에는 ASO 및 SIRNA가 포함됩니다. 우리가 생체 내라고 부르는 이유는 우리가 제공하는 약물이 다른 약과 마찬가지로 인간에게 직접 투여하고 질병을 치료하기 때문입니다. 생체 외(ex vivo)라고 하는 두 번째 범주는 인간 환자 세포를 꺼내 유전자 변형, 확장 및 다시 주입하고 변형된 세포가 환자에게 살아있는 약물로 기능하여 치료 결과를 완성합니다. 그리고 FDA와 EMRA가 승인한 4가지 약물이 있습니다.

 

이것이 전반적인 전략이며 유전자 기반 치료에 대한 기존의 접근 방식 측면에서 다음 범주로 요약하고 싶습니다. 첫 번째는 기능 상실이 있을 때 이러한 정상 유전자를 대체하고 유전자 치료를 수행하는 것인데, 이를 유전자 대체라고 합니다. 두 번째 범주는 유전자에 돌연변이가 없을 수 있지만 유전자 추가 요법을 달성하기 위해 과발현을 통해 외인성 또는 내인성 유전자를 얻을 수 있습니다. 세 번째는 기능이 상실되고 유전자가 독성을 갖게 되면 분자를 전달하여 해당 유전자를 침묵시킬 수 있다는 것입니다. 마지막으로 유전자 편집을 통해 유전자와 그 발현을 조절할 수 있습니다.

 

그래서 그것들은 접근 방식이지만 유전자 치료 연구의 핵심 구성 요소는 무엇입니까? 치료용 유전자, 벡터, 표적 조직을 안전하고 효율적으로 투여하기 위한 투여 경로, 효능과 안전성을 연구하기 위한 동물 모델의 네 가지로 요약하겠습니다. 그 중에서도 벡터는 유전자 치료에 가장 중요한 구성 요소입니다.

 

유전자 치료사로서, 생체 내 유전자 전달을 위한 바이러스 벡터의 바람직한 특징은 다음과 같다. 첫째, 우리는 아데노 바이러스와 같은 고효율을 원하고, 렌티 바이러스와 같은 장기적인 안정성을 원하며, 면역 원성과 독성을 원하지 않으며, 유전 독성을 원하지 않습니다. 사실, 이제 우리가 가지고 있는 모든 바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스는 모든 것을 가지고 있습니다. 이 바이러스는 단일 가닥 아데노바이러스이며 단백질 캡시드이며 조절 단백질과 캡시드 단백질로 구성됩니다. 또한 AAP 및 MAAP와 같은 일부 보조 단백질이 있습니다. 가장 중요한 것은 현재까지 이 바이러스의 모든 질병에 대한 인과 연관성에 대한 직접적인 증거가 없다는 것입니다.

 

이 바이러스를 벡터로 어떻게 변환합니까? 기본적으로 바이러스 유전자를 꺼낸 다음 치료 유전자 카세트로 교체한 다음 도우미 기능과 Rep/Cap 기능을 제공하고 이러한 모든 구성 요소를 일시적이거나 안정적인 형질감염 또는 바큘로, 아데노 또는 헤르페스 바이러스와 같은 감염이 될 수 있는 세포에 넣습니다. 그런 다음 재조합 AAV를 생성합니다. 이 시스템의 장점은 캡시드를 간단히 교체할 수 있다는 것인데, 이 경우 AV9로 교체한 다음 벡터의 생물학이 주로 캡 자체에 의해 결정되기 때문에 AV9 바이러스가 됩니다. 이제 AAV 매개 유전자 치료는 실제로 팀워크입니다. 캡시드는 매우 중요합니다. 어떻게 옷을 입느냐가 중요합니다. 그것은 조직 친화성과 세포 내 밀매를 지시하고, 숙주 면역 반응을 지시하며, 치료 유전자를 핵에 전달합니다.

 

캡시드는 AAV 벡터에 가장 중요하기 때문에 벡터 개발은 캡시드 발견을 중심으로 이루어집니다. 첫 번째 전략은 자연 저수지를 찾는 것입니다. 이 경우 염기서열을 식별하고, 캡처한 다음, 높은 처리량의 in vivo 평가를 거칩니다. 두 번째 전략은 유도 진화라고 합니다. 세 가지 전략이 있는데, 첫 번째 전략은 캡시드 셔플링(capsid shuffling)이라고 하고, 두 번째 전략은 에러 프롱 PCR(error prong PCR)이라고 하며, 이러한 수단을 통해 새로운 AAV 캡시드의 변이체를 생성할 수 있습니다. 세 번째 접근 방식은 펩타이드 삽입이며, 기본적으로 무작위 펩타이드의 캡시드 표면 패닝을 수행하고 이러한 삽입으로 새로운 캡시드를 생성합니다. 세 번째 전략은 합리적인 디자인입니다. 기본적으로 캡시드 구조-기능 관계를 기반으로 하거나 조직 친화성 수용체/리간드 엔지니어링을 리디렉션합니다. 그리고 최종 전략은 인실리코 설계 또는 기계 학습이라고 합니다. 이것은 계통발생학적 분석과 컴퓨터 과학을 기반으로 합니다. 그리고 현재 가장 인기 있는 접근 방식은 실제로 경로 삽입이며, 지난 몇 년 동안 많은 벡터가 이 경로를 통해 생성되었습니다.

 

저의 AAV 유전자 치료 경력은 90 년대 펜실베니아 대학의 제임스 윌슨 박사와 함께 차세대 AAV를 찾기 시작했습니다. 이 전략은 2001년에 시작되었습니다. 우리는 프라이머, 네오 튜브 보존 도달 및 캡시드의 일반 라이브러리를 설계했습니다. 예를 들자면, AAV9는 오늘날 희귀 질환에 대해 가장 인기 있는 AAV입니다. 이는 21년 2003월 9일에 인간 간 샘플을 발견한 것이다. 여기에서 볼 수 있듯이, 그것은 우리가 포함하는 PCR 밴드이며, 우리는 인간 조직에 증폭되어 이 AAV2를 포함하고 이것은 topochromic 클론이며, 이것은 강력한 transcytosis에서 바이러스의 아름다움을 나타내며 혈관 구조를 가로질러 근육, 간을 통해 transgene을 널리 퍼뜨리고 가장 중요한 것은 혈액 뇌 장벽을 통과하여 이 거래를 널리 볼 수 있습니다. 우리는 또한 최근에 V66이라고 불리는 또 다른 AAV2 천연 변종을 발견했습니다. 보시다시피 AAV13와 매우 가까운 상대입니다. 그리고 이 바이러스는 AAV2와 13개의 아미노산 차이만 있습니다. 그러나 이 차이로 인해 해마내 주사 후 신경성으로 <>배 더 커집니다.

 

이것이 캡시드입니다. 그러나 내가 말했듯이 AAV는 팀워크입니다. 게놈 자체는 매우 중요합니다. 이러한 치료학적 페이로드 담체는 치료적 이점을 매개하고, 형질전환된 세포에서 장기간 체류를 달성하며, 선천성 및 적응성 형질전환 유전자 면역을 유발하며, 양호한 설계가 없는 경우 잠재적으로 다른 이식유전자 관련 독성을 유발한다. 그리고 실제로 벡터를 엔지니어링하는 것은 2000년대 초반에 [name]과 Dr. McCarty의 선구적인 작업을 보여주듯이 말단 반복인 ITR에서 시작할 수 있습니다. 단일 가닥 DNA를 사용하면 최대 5KB까지 올라갈 수 있으며, 단일 가닥 DNA로 포장되어 일단 세포에 들어가면 이 두 번째 가닥 합성 또는 자가 대립유전자를 거쳐 형질도입 활성 바이러스를 생성할 수 있습니다. 이것은 마우스 변이체에서 두 가지 다른 선량이지만, 그 과학자들은 하나의 ITR을 수정하고 돌연변이 ITR을 만든 다음 패키지화할 때 두 개의 사본의 미러 이미지로 패키징하고 이중 가닥에서 뒤로 접습니다. 이렇게 하면 여기에서 볼 수 있듯이 두 번째 가닥 합성, 즉 발현의 조기 발병 및 높은 수준의 효율성을 우회할 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 단일 가닥과 이중 가닥 사이에는 최소 10배의 차이가 있습니다. 두 번째 엔지니어링은 전사 조절이 될 수 있습니다. 유비쿼터스 프로모터 AAV9 단일 IV 주사를 사용하면 많은 상이한 조직을 형질도입한다. 다른 조직 특이적 프로모터를 추가하면 해당 조직의 거래를 제한할 수 있습니다. 뉴런 프로모터 또는 신경교 프로모터를 사용하여 세포 특이적 단일 형질도입을 달성함으로써 세포 특이적 프로모터를 사용할 수 있다. AAV의 아름다움은 한 번의 주사로 장시간 유지할 수 있으며, 이는 유비쿼터스 프로모터 발현이며, 이는 <>년 동안 원숭이 근육에서 동등하다. 그러나 조절된 프로모터를 추가할 수도 있으며, 이 경우 에리스로포이에틴은 원하는 수준과 간격으로 유도성 프로모터를 가질 수 있습니다.

 

당신이 할 수 있는 또 다른 엔지니어링은 전사 후 조절입니다. 이 경우, 이러한 microRNA 결합 부위 없이 조직을 내려올 때 3구 UTR에 microRNA 결합 부위를 추가할 수 있으며, CNS 및 말초 조직에서 아름다운 발현을 갖게 된다. microRNA 결합 부위를 발현하는 조직에 들어가면 메신저가 CLIP이 되고 CNS에서만 발현됩니다. 다른 전사 액세서리인 cDNA에 대해 또 다른 엔지니어링을 수행할 수 있으며, 이는 훨씬 강력한 cDNA 카세트를 생성하기 위해 Kozak 서열 및 이식유전자 코드 최적화가 될 수 있으며 더 높은 발현을 얻기 위해 인트론을 개선할 수 있습니다.

 

그러나 cDNA를 조작할 때 강력한 발현을 유지하려면 CPG 함량과 코돈 최적화의 균형을 맞춰야 한다는 점을 경고해야 합니다. 두 가지 상반된 사실이 있기 때문입니다. 즉, 발현과 DNA 전송 사이의 균형이 있을 뿐만 아니라 발현의 안정성 뿐만 아니라 CpG 섬의 감소가 있을 때 이러한 안정성이 향상될 것이다. 그러나 코돈 최적화를 완료하면 DNA 감지와 안정성이 있고 발현은 증가하지만 안정성은 감소합니다. 균형은 높은 수준이지만 안정적인 표현을 달성하는 열쇠입니다.

 

그것이 AAV의 기본입니다. rAAV 유전자 치료의 현재 상황에 대한 개요를 알려 드리고자합니다. 우리는 설문 조사를 수행했으며 현재 13 가지 질병과 조직 표적이 있음을 발견했습니다. 그 중에서도 보시다시피 CNS는 여기에서 볼 수 있듯이 가장 뜨거운 대상입니다. 유전자 치료를 할 때 CNS의 유전자 치료 표적이 있기 때문에 유전자 치료를 위해 고려해야 할 몇 가지 요소가 있습니다. 먼저 질병 병리의 분포 및 분자 메커니즘에 대해 생각할 때, 여기에는 국소 대 글로벌 pan-CNS 병리가 포함됩니다. 유전학 대 후성 유전학에 대해 생각할 때, 이득 대 기능 상실 대 일배체 부족. 두 번째 인자는 세포 표적입니다. 여기에는 신경 발달, 정신 및 신경 퇴행성 질환과 같은 신경 세포와 백혈구 이영양증과 같은 신경교가 포함될 수 있습니다. 혈액 뇌 장벽은 주요 전달 장벽이며 극복하기 위해 다른 접근 방식을 가져야 합니다. 첫 번째는 직접 CNS 주입이며, 보시다시피 직접 주사를 통해 CNS에 유전자를 전달하는 다양한 방법이 있습니다. 혈관 내/전신 주사로 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있는 AAV를 사용할 수도 있습니다.

 

제가 여러분의 관심을 끌고 싶은 한 가지는 신경 발달 및 정신 장애의 일반적인 유전적 원인이기 때문에 일배체 기능 부전입니다. 그리고 이러한 유형의 질병에 대한 이러한 치료법에 대한 접근 가능성은 먼저 cDNA 유전자 증강을 전달할 수 있다는 것입니다. 우리는 또한 DNA/RNA 편집에 의해 돌연변이 대립유전자를 복구할 수 있으며, CRISPRa 활성화를 통한 유전자 활성화 또는 생산적인 전사체를 통한 ASO를 통해 돌연변이 유리 대립유전자의 발현을 높이고 ASO에 의한 전사체 안정성을 향상시킬 수도 있습니다.

 

내가 지적하고 싶은 또 다른 접근법은 말도 안되는 돌연변이에 대한 판독 치료입니다. 아시다시피, 모든 병원성 돌연변이의 11 %는 말도 안되는 돌연변이입니다. G48 및 ACT128과 같은 저분자 약물을 사용할 수 있지만 억제 tRNA를 사용할 수도 있습니다. 이러한 haploinsufficiency 유전자 치료에서 고려되는 인자는 먼저 유전자 발현의 엄격한 조절을 필요로 한다. 여기에는 유전자 복제가 독성이 있는 경우가 많다는 것을 알고 있는 수준 발현이 포함됩니다. 둘째, 해부학 영역과 조직 세포 유형에 따라 다릅니다. 세 번째 창은 발달 질환이 있기 때문에 창을 놓치고 치료 효과가 떨어질 수 있습니다. 두 번째 큰 범주는 프로모터, 자가 조절 및 음성 피드백이며 microRNA 조절 피드백을 포함합니다. 세 번째는 때때로 돌연변이 대립유전자가 순전히 기능의 상실이 아니라는 것이다. 이 경우 돌연변이 대립 유전자를 녹다운시키고 동시에 정상 유전자를 증가시킵니다.

 

사실 저는 제 동료 교수인 Dan Wang과 그의 그룹이 직장에서 몇 가지 개념을 소개하고 싶습니다. 그가 하려고 했던 것은 판독 치료를 위해 AAV 억제 RNA를 사용하는 것이었습니다. 규칙적인 tRNA와 규칙적인 정지 코돈이 있지만 조기 종결 코돈도 있을 수 있습니다. 그리고 suppresser tRNA는 천연 tRNA와 단 하나의 차이점을 가지고 있다. 그래서 그룹은 새로운 기회를 위해 이 오래된 개념을 선택합니다. 레트 증후군, FoxG1, CDKL5, 드라벳 증후군 등의 치료를 위한 연구를 진행하고 있습니다. 장기 납품은 AAV 이점입니다. 물론 한 가지 관심사는 글로벌 판독 및 섭동 신장이며 tRNA 시퀀싱, 리보솜 프로파일링을 수행하고 있습니다. Dan이 이 접근법을 선택한 이유는 단일 억제기 tRNA가 다른 돌연변이와 다른 표적 유전자를 공격할 수 있기 때문에 한 명의 스톤 킬 전문가를 사용할 수 있기 때문입니다. 이제 더 높은 효능의 다중 발현 카세트를 넣으면 외인성 단백질이나 이식유전자 면역이 없음을 알 수 있습니다. 그리고 이것은 과발현이 아닌 이식유전자 조절의 통제 하에 있습니다. 그리고 이것은 엔지니어링 및 일시적인 전달에 적합합니다. 그래서 -

 

무스타파 사힌 : 2분.

 

광핑 가오 : 예. 이 방법으로 AAV를 사용하여 Dan은 개념에 헐러 모델을 사용했습니다. 전신 전달을 통해 10주 만에 IDUA의 부분적 회복을 볼 수 있고 <>주 후에 소변 GAG 기질의 정상화를 볼 수 있습니다. 개별 조직을 보면 더 높은 발현을 보이거나 GAG가 거의 완전히 정상화되었음을 알 수 있습니다. 전신 주사로 뇌를 표적으로 삼는다면 이 용량은 그다지 효과적이지 않습니다. 그러나 두개 내 주사를하면 부분적으로 뇌 활동을 회복 할 수 있음을 알 수 있습니다. 그러나 그것은 StRNA가 매우 효과적이라는 것을 보여줍니다. 그러나 이것이 질병 치료에 안전한가?

 

그들은 또한 리보솜 발견에 의해 이것이 안전한지 분석합니다. 그리고 이 경우 환자 섬유아세포에서 G418이 표적 글로벌 속도에서 교란을 일으킨다는 것을 보여주지만, StRNA에 의한 것은 아닙니다. 또한 마우스 간에서도 같은 상황입니다. 또한 G418이 이러한 StRNA 구축물에 의해서가 아니라 신장의 교란을 일으킨다는 것을 보면, 시험관 내 환자 섬유아세포 및 마우스 간에서 연신율을 일으킨다.

 

정말 고마워요. 나는 여기서 끝내고 싶다. 동료들에게 감사하고 싶습니다. 우리 그룹은 Dr. Xia와 Wang 및 Tai를 포함하는 4명의 PI가 지휘하는 큰 그룹입니다. 벡터 코어에 감사를 표하고 싶습니다. 발표할 기회를 주셔서 대단히 감사합니다. 다음 연사는 보스턴 아동 병원의 Sahin 박사입니다. 그는 희귀 유전 질환과 신경 발달 장애에 대한 개요를 제공할 것입니다. 감사합니다.

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